《這天,我與病毒為伍》
👁找到呼吸道病毒🦠的基因體🧬有多難呢?
說穿了 也不是很難
比驗孕稍微難一點而已
🫁從肺部支氣管的相關位置採樣(例如鼻腔後)
或是肺部組織(動物才會這樣做)
加入Trizol reagent 💀💀把組織分解後
以1/5的比例加入 chloroform 💀💀
搖勻呈現乳糜狀後 🧪🧪
13500g 攝氏4度 離心15分鐘後
呈現三層分離(如最後一張圖)
最後非常仔細小心地取出上層透明的部分
再加入等體積的 isopropanol ⚗️
搖勻後 攝氏四度靜置五分鐘
13500g離心十分鐘
得到沉澱物 即為total RNA sample🧬🧬
(包括環境細菌的、你身體的、病毒的以及死細胞的)
為了去除殘留的isopropanol,chloroform
需加入 75% 乙醇(in DEPC-double_Distilled water , ddH2O)
並搖晃使沈澱物飄起
再以13500g攝氏四度 離心五分鐘
(重複上述步驟兩次)
最後風乾後 以DEPC-ddH2O回溶⚱️⚱️
最後在nano-drop測定RNA concentration
(一個sample大概五十分鐘
當sample量變成16個時 會變成1.5小時)
為何是 16個? 🏇🏻🏇🏻
別急, 慢慢看完。
(如果你不耐煩了....你知道有多麻煩了嗎?)
😁😁😁
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由於RNA sample 是各種奇怪RNA🔭🔭
又怕殘留DNA
所以必須事先加入 DNase-I 去除DNA
並為了避免RNA損壞 要額外加入 RNase inhibitors
隨後~
我們將RNA 以 反轉錄的方式 變成互補DNA( complementary DNA)
約需要200 ng~1000ng 的總RNA
歷經一個小時的Reverse transcriptase PCR的努力 將RNA全部變成cDNA🪣🪣
再將cDNA 稀釋成 5~15 ng/ul
(你沒看錯~ 就是 千分之一毫升)🩸
最後把 cDNA樣品放入 第一張圖的白盤中
白盤在共有96格(約12*8公分)
接著 與 病毒基因體的引子(primer)🧬
與SYBR-green(螢光探針-🔮聚合酶複合物)混合
總體積約10~20 ul
所以他的滴管也非常的小(如第二張圖)
之後 需要1.5小時的時間 進行35~40重複的PCR program
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為什麼是 16個樣品呢?
96格 一個樣品需要三重複
所以剩下32個樣品
一個樣品需要一個基因陽性對照組(你身上一定會有的基因,通常是B-actin ,GAPDH,alpha-tubulin...)
所以就剩下16個
這時候... 手套已經戴了一個下午
手已經爛了(如第三張圖)
終於可以坐下了....?
沒有...因為還有成千上百個待測樣品🛎🛎🛎
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而得到的數據最重要的就是Ct 值🧲🧲🧲🧲
Ct( threshold cycle number)
意思是 cDNA被酵素放大的次數
而在某次的放大過程中
螢光的亮度被機器偵測到
亦即樣品中的目標基因量很足夠
此數值可視為間接代表基因的表現量
因此視為病毒感染指標💣💣💣💣
又因為每次挖到的樣品不同
或是下樣的誤差
我們必須將你身上最穩定出現的基因Ct
與病毒基因的Ct
做一次 deltaCt(這裡就是 數據常用的水平校正)⚒⚒
到這裡就會知道不同病毒基因的表現差異
🗿🗿🗿🗿
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為何找到新病毒株這麼慢?🤢🤢
分離病毒株需要藉由許多分層離心的梯度
最常使用的是sucrose-gradient 或是 CsCl-gradient 並使用超高速離心(約 180000g)
(我沒有多打一個0,他就是十八萬g)
分出來的每一個濃度梯度 都可以做一次樣品的採樣
要怎麼找到他呢?👐🏽👐🏽👐🏽
我們要在一個約0.3cm的銅網上(如第四張圖)
你沒看錯 就是中間那顆小水滴🩸🩸
將病毒樣品放在上面 烘乾一天
如果病毒太小就得用UA(Uranyl Acetate) 做染色🪆🪆
之後以穿透式電子顯微鏡(TEM)
在銅網中的300個洞中
找到病毒
知道敵人是誰後....
再進行蛋白質晶體繞射
找到推測的蛋白質結構
進行基因定序😾
才能告訴你 那是誰🙀
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如果你看完了
謝謝你
因為你知道為什麼這麼慢了
沒看完-沒關係
因為你永遠不會懂我們多無奈
檢驗人員的大拇指加一次樣品要按96次
一個樣品有三種東西
總共要按288次
比較有錢的實驗室會有 八爪 十二抓
省去時間
你的大拇指能動幾次不累呢?
在0.3公分-300洞裡找病毒
在12*8的盤子上下樣品
在一天內要重複這件事 至少10次
下班回家還要看新聞被你們罵 驗太慢
💩💩💩
台灣人,我打的流程 你是不是看不懂?
對,那請你乖乖在家
除了別亂跑
記得給我們一點鼓勵
不要以為你都懂
其實你知道的真的比你想像的還少。
而人本來就不會什麼都懂
每個專長都值得被尊敬
你也希望你被尊敬
當然我們也需要
不然你動一下手指就好
分享出去... 戰場上的士兵 需要被知道